ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE COMBRETUM LEPROSUM MART. (COMBRETACEAE) ATRAVÉS DA TÉCNICA LC-MS

REGISTRO DOI: 10.5281/zenodo.15401111

Francisco José Mininel¹
Silvana Márcia Ximenes Mininel²

RESUMO
Combretum leprosum Mart. é uma espécie neotropical com ocorrência registrada no Brasil e Paraguai. Trata-se de uma espécie de fácil identificação pelo hábito arbustivo, frequentemente escandente, as vezes volúvel, pelas folhas verde-acinzentadas, flores com hipanto superior alongado-campanulado e pétalas arredondadas a oblatas. As aplicações medicinais da espécie são amplamente relatadas na literatura, utilizando-se a casca, folhas e flores como agentes cicatrizantes. Dada a importância farmacológica, este trabalho teve como objetivo fornecer dados sobre a fitoquímica da espécie utilizando a técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). Observou-se na espécie, uma preponderância de compostos tânicos. Foram identificados ácido gálico, galato de metila, ácido elágico, derivados do ácido elágico e ácido galágico.
Palavras-chave: Combretum leprosum Mart. Fitoquímica. Taninos.

ABSTRACT
Combretum leprosum Mart. is a Neotropical species with occurrences recorded in Brazil and Paraguay. It is an easily identifiable species due to its shrubby habit, often climbing, sometimes voluminous, grayish-green leaves, flowers with an elongated-campanulate upper hypanthium and rounded to oblate petals. The medicinal applications of the species are widely reported in the literature, using the bark, leaves and flowers as healing agents. Given its pharmacological importance, this study aimed to provide data on the phytochemistry of the species using the liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) technique. A preponderance of tannic compounds was observed in the species. Gallic acid, methyl gallate, ellagic acid and ellagic acid derivatives and gallagic acid were identified.
Keywords: Combretum leprosum Mart. Phytochemistry. Tannins.

INTRODUÇÃO

Combretum leprosum Mart. (COMBRETACEAE) apresenta-se como arbustos escandentes 2-3 m alt., cobertos por tricomas lepidotos brilhantes, hialinos ou esbranquiçados. Folhas 5,3-10,2 × 2,9-6,9 cm, lâmina elíptica a largamente elíptica ou arredondada, ápice agudo a acuminado, base aguda a arredondada; venação eucamptódroma-boquidódroma, nervuras proeminentes em ambas as faces; pecíolo 6-11 mm compr. Inflorescências 23 cm compr., panícula de racemos duplos, axilares e terminais. Bractéola única, 1,5-2 mm compr., linear; botão floral 4,0-4,5 × 1,5-2,5 mm, turbinado. Flores 9-10 mm compr.; hipanto inferior 1,5-2 mm compr., fusiforme, densamente lepidoto; hipanto superior 3,5-4,5 × 3-4 mm, alongado-campanulado, esparsamente lepidoto, esverdeado; lobos do cálice 8-10 × 1-1,5 mm, estreito a largamente triangular; pétalas 1-1,5 × 1-1,5 mm, arredondadas a oblatas; estames 8, exsertos; filetes do verticilo interno 3,5-4 mm compr., filetes do verticilo externo 4,5-5 mm compr.; anteras 0,4-0,5 × 0,4-0,5 mm, elípticas; disco nectarífero 4-6 mm compr., glabro; ovário 0,4-0,5 mm compr., adnato ao hipanto inferior; estilete 4-6 mm compr., filiforme; estigma incospícuo. Fruto 1,8-2,4 × 1,8-2,1 cm, largamente elíptico; alas 2-2,5 × 5-7 mm, transversalmente estriadas; região central 17-20 × 4-5 mm, pedicelo frutífero 1-2,5 mm de comprimento (Figura 1). O fruto indeiscente é uma sâmara glabrescente e tetra-alada medindo de 1,8 a 2,5 cm de comprimento por 1 a 2,1 cm de largura. Largamente elíptico, suas alas medem de 5 a 7 mm de largura e são estreitamente estriadas. Cada fruto  porta uma semente estreito-elíptica a ovalada com testa coriácea e sulcada longitudinalmente. Branco-esverdeada no fruto imaturo e castanho-escura no fruto maduro mede 0,9 a 1,2 cm por até 0,5 mm de largura (Figura 2).

Combretum leprosum Mart. é uma espécie neotropical com ocorrência registrada no Brasil e Paraguai. Trata-se de uma espécie de fácil identificação pelo hábito arbustivo, frequentemente escandente, às vezes volúvel, pelas folhas verde-acinzentadas, flores com hipanto superior alongado-campanulado e pétalas arredondadas a oblatas (LORENZI, 2008).

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Um dos constituintes químicos mais notáveis ​​do Combretum leprosum Mart & Eic é a (-) epicatequina (Figura 2). É um flavanol pertencente à família das catequinas e está comumente presente em formas monoméricas e/ou oligoméricas em chás verdes e vinho tinto. Um flavonoide conhecido principalmente por suas propriedades antioxidantes, cardioprotetoras, anti-inflamatórias e antineoplásicas (TERAO et al, 1994).

De acordo com dados da literatura, estudos demonstraram que essa classe de substâncias tem a capacidade de bloquear alguns subtipos de canais de sódio, incluindo células neuronais in vitro, o que pode estar relacionado a possíveis propriedades antinociceptivas (DENG et al, 2008). Outros estudos demonstraram que compostos polifenólicos têm propriedades inibitórias na formação de óxido nítrico, um importante indicador dos fenômenos envolvidos na nocicepção (ACHIKE & KWAN, 2003). É interessante notar que quase nenhum estudo na literatura avaliou a ação da (-) epicatequina em modelos de nocicepção in vivo.

Estudos realizados por Lopes et al (2012), demonstraram que a atividade antinociceptiva do EPI no modelo glutamato envolve a participação do sistema opioide, serotoninérgico, adrenérgico e colinérgico. Observaram que a ação antinociceptiva da EPI é revertida pelo antagonismo da naloxona, o que confirma a possível ativação de receptores opioides pela EPI. Esse efeito também foi revertido pela atividade da glibenclamida, um antagonista dos canais de K+ sensíveis ao ATP, demonstrando o envolvimento da ativação desses canais pela EPI. Essa ação esteve diretamente relacionada à inibição da transmissão nociceptiva.

Em trabalho de De Araujo et al (2022), indica que é urgente de encontrar novas substâncias bioativas que possam ser eficazes contra parasitas sem causar tantas complicações ao hospedeiro, por exemplo, o T. ccruzi, causadorda doença de chagas. Neste estudo, o triterpeno 3β-6β-16β-tri-hidroxilup-20 (29)-eno (CLF-1) foi isolado de Combretum leprosum , e sua estrutura molecular foi determinada por RMN e espectroscopia de infravermelho. O CLF-1 também foi avaliado in vitro e in silico como potencial agente tripanocida contra formas epimastigotas e tripomastigotas de Trypanosoma cruzi (cepa Y). O CLF-1 demonstrou bons resultados destacados por IC ₅₀ mais baixo (76,0  ±  8,72  µM, 75,1  ±  11,0  µM e 70,3  ±  45,4  µM) para epimastigotas em 24, 48 e 72  h, e LC ₅₀ (71,6  ±  11,6  µM) para formas tripomastigotas.

METODOLOGIA

Material

O material botânico destinado ao presente trabalho foi coletado no Campus da Universidade Brasil, no município de Fernandópolis, estado de São Paulo. No campus da Universidade Brasil, um exemplar de porte arbóreo foi encontrado tendo seu tronco ereto e superficialmente canelado mede de 40 a 60 cm de diâmetro e possui ritidoma cinza-pardo e irregularmente escamoso. A confirmação da espécie foi feita pelo professor Dr. Angelo Simonato.

Procedimentos adotados na análise do extrato hidrolacoólico.

Para obter o extrato hidroalcóolico Combretum leprosum Mart., primeiramente realizou-se a coleta das folhas. Em seguida o material vegetal foi seco a temperatura ambiente durante uma semana, foi triturado e resultou em uma massa de cerca de 500 gramas. Por fim, preparou-se o extrato usando um volume de 1,5 L de álcool etílico, depois filtrou-se o extrato e realizou mais extrações, resultando em um total de seis extrações. Para os testes fitoquímicos, utilizou-se a metodologia proposta por Matos (2009) para a identificação das classes de metabólitos. E posteriormente realizou-se uma análise em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS) desse extrato para caracterizar algumas substâncias presente nessa espécie vegetal. A figura 3 ilustra o fluxograma do procedimento experimental aplicado nesse estudo (DALLUGE et al, 1998).

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Numerosos métodos de extração e estudo de compostos, oriundos de plantas, têm sido sugeridos pela literatura (MATOS, 1998). Realizar um estudo fitoquímico é um desafio a ser realizado pelo farmacêutico, visto que o uso das espécies vegetais para fins medicinais é crescente e preocupante. É necessário analisar o maior número possível de espécies, tendo em vista o grande número que falta a ser estudado para a flora brasileira, sempre com a preocupação de validar plantas medicinais consagradas pela medicina popular. As análises fitoquímicas fornecem informações relevantes à cerca da presença de metabólitos secundários nas plantas, para que assim possa chegar ao isolamento de princípios ativos importantes na produção de novos fitoterápicos.

Pesquisa de classes de substâncias nas drogas de folhas de Combretum leprosum Mart.

Caracterização biológica de extratos simples das drogas de folhas e frutos.

Tabela 3. Resultado da reação indicativa de taninos por hemoaglutinação.

+ = positivo

Resultado das reações gerais indicativas da presença de taninos.

Tabela 4. Reações gerais indicativas da presença de taninos.

++ = formação de precipitado com intensidade média

+++ = formação de precipitado com muita intensidade

Resultado das reações específicas indicativas da presença de taninos.

Tabela 5. Reações específicas indicativas da presença de taninos.

+ = positivo

Caracterização de alcaloides em extratos simples das drogas de folha e frutos.

Tabela 6. Resultado das reações gerais indicativas da presença de alcaloides.

+ = positivo

Caracterização de antraderivados através da reação geral de Bortraeger em extratos simples.

Tabela 7. Resultado da reação geral indicativa da presença de compostos antraquinônicos.

- = negativo

Tabela 8. Resultado das reações químicas e microquímicas presença de compostos antraquinônicos.

- = negativo

Tabela 10. Reações indicativas da presença de flavonoides.

+ = positivo

Análise do extrato hidroalcoólico por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS).

Avaliação do perfil cromatográfico obtido (Figura 3) mostrou claramente a complexidade desta matriz e a eluição característica de um pico bastante alargado em cada cromatograma foram outros indicativos da presença de classes de taninos em Combretum leprosum Mart.

Com o auxílio do detector PAD realizando varredura, algumas classes de substâncias foram identificadas no extrato hidroalcoólico das folhas de Combretum leprosum Mart.

O composto (a) foi identificado como ácido elágico (Figura 4) com base no tempo de retenção do padrão autêntico. Isso foi confirmado posteriormente pela análise ESI-MS que mostrou um pico de íon molecular proeminente em 300 correspondendo ao ácido elágico. O estudo de ¹ H-NMR revelou apenas um próton aromático em δ 7,3 (s).

O padrão de fragmentação do ácido elágico (Figura 5) constitui-se basicamente das perdas no espectro de segunda ordem de 44 Da (CO₂) e 28 Da (CO) (SANTOS et al., 2013). Estes íons foram detectados a partir do íon precursor m/z 301 (Figura 4.2.18), originando os íons m/z 257 [M – H – CO₂]^- , m/z 229 [M – H – CO₂ - CO]^- e m/z 185 [M – H – 2CO₂ – CO]^- respectivamente (MULLEN et al., 2003; SEERAM et al., 2006).

O Espectro na região de UV (pico λmax 271 nm), eluindo em tr 8,72 min. é característico do ácido gálico (Figura 6). O Espectro na região de UV, eluindo em tr 19,62 min. é característico do galato de metila (λmax 274 nm).

A análise por FIA indicou também a presença do ácido galágico (m/z 601). Analisando a fragmentação de segunda-ordem do íon precursor em m/z 601 (Figura 7) verifica-se a formação de um fragmento em m/z 494 e perda do íon com m/z 107.

Dessa forma, podemos inferir que Combretum leprosum é uma fonte de taninos e suas propriedades adstringentes e outras aplicações terapêuticas são reconhecidas em estudos e na prática médica tradicional. 

De acordo com dados da literatura é possível afirmar que os galhos de Combretum leprosum (mufumbo) apresentaram maior concentração de taninos com 436,3 ppm em relação as demais partes analisadas, seguido das folhas com 310,8, e o de menor concentração é a raiz com 3,3 ppm. Sabendo que as concentrações encontradas variam de acordo com cada planta, de sua idade e de seu tamanho (MONTEIRO et al., 2005).

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A espécie Combretum leprosum Mart., conhecida popularmente como mufumbo, por possuir uma atividade antiinflamatoria comprovada, tem despertado interesse para o estudo da mesma devido aos seus beneficios.

A abordagem fitoquímica permitiu observar uma variedade de classes de substâncias presentes nas folhas da espécie vegetal, tais como, taninos, alcalóides, flavonoides.

A espécie vegetal exibiu alta concentração de taninos. Os taninos são compostos secundários, presentes na maioria das plantas, que podem variar de concentração nos tecidos vegetais. Observou-se a presença de ácido elágico e derivados, ácido gálico e derivados, bem como a presença de ácido galágico, identificados por técnicas de LC-MS.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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DE ARAÚJO, José Ismael F. et al. Antiproliferative activity on Trypanosoma cruzi (Y strain) of the triterpene 3β, 6β, 16β-trihidroxilup-20 (29)-ene isolated from Combretum leprosum. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, v. 40, n. 22, p. 12302-12315, 2022.

DENG, H.M.; YIN, S.T.; YAN, D.; TANG, M.L.; LI, C.C.; CHEN, J.T. Efeitos do EGCG em canais de sódio dependentes de voltagem em culturas primárias de neurônios CA1 do hipocampo de ratos. Toxicologia, 2008.

LOPES, Luciano da Silva et al. Mechanisms of the antinociceptive action of (−) epicatechin obtained from the hydroalcoholic fraction of Combretum leprosum Mart & Eic in rodents. Journal of Biomedical Science, v. 19, p. 1-6, 2012.

LORENZI, H.; MATOS, F.J.A. Plantas Medicinais no Brasil: nativas e exóticas. 2.ed. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 2008.

MATOS, FJ de A. Introdução à Fitoquímica Experimental, 3ª. Edição, UFC, Fortaleza, 2009.

MONTEIRO, Julio Marcelino et al. Taninos: uma abordagem da química à ecologia. Química nova, v. 28, p. 892-896, 2005.

TERAO, J; PISKULA, M; YAO, Q. Efeito protetor do galato de epicatequina e da quercetina na peroxidação lipídica. Arch Biochem Biophys, 1994.

¹ Docente do Curso Superior de Farmácia da Universidade Brasil, Campus de Fernandópolis-SP. Doutor em Química pelo Instituto de Química UNESP, Campus de Araraquara-SP. E-mail: [email protected]

² Docente do Curso Superior de Farmácia da Universidade Brasil, Campus de Fernandópolis-SP. Mestre em Química (PPGQUIM/UNESP - Araraquara-SP). E-mail: [email protected]